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    發布日期:2021-12-13 14:31:00

     

     

    引言:方法開發是個復雜而又神秘的工程,往往需要扎實的理論知識儲備,但同時也少不了經驗的積累;對于方法開發,需要我們從多學科出發,分析儀器學、色譜學、藥學、有機化學、分析化學等學科綜合,也需要我們熟練掌握文獻信息檢索,從中吸取精華,同時不斷去試錯,下面就把我個人職業生涯的經驗進行總結提煉,供同行一起學習探討,有不足之處需要同行前輩予以指正。

    一、確認開發工作內容

    1.殘留溶劑檢測分析方法:GC-HS方法、GC直接進樣方法

    2.基因毒雜質檢測分析方法

    3.高沸點樣品雜質分離與含量檢測方法

    二、信息收集

    1.首先要確定待測物質的溶解性、極性、沸點,主要針對“溶劑殘留”;

    2.其次還需要確定樣品的溶解性、熱穩定性、極性、沸點、化學性質(酸堿)、物理屬性(固體/液體/半固態)。

    三、色譜柱使用選擇指南(分離關鍵)

    四、進樣方法的選擇

    1.方法有:溶液直接進樣法、頂空進樣

    ①殘留溶劑-HS:大多數是低沸點物質(醇/酯/烷烴/醚),90%以上采用頂空進樣(GC-HS),清潔進樣,基本不出雜峰(溶劑),原料不被破壞但經濟費用高。

    ②殘留溶劑-DS:5%及少數采用溶液直接進樣(GC-DS),經濟,但出雜峰多(主要原料破壞帶入),易損壞色譜柱需清潔老化保護。

    ③開發選擇考慮總結:

    2.溶劑沸點過高(沸點大于180℃),且樣品對熱比較穩定首選溶液直接進樣法;

    3.溶劑沸點低(沸點小于150℃),且樣品對熱不穩定首選頂空進樣法;

    4.頂空進樣法可消除因溶液直接進樣會產生降解雜質峰而干擾目標峰(進樣口溫度大于200℃),采用頂空進樣方法還可以減少對樣品的預處理。

    5.基因毒雜質方法開發,優先選擇溶液直接進樣法(限度低,主要考慮提高靈敏度);樣品雜質分離選擇使用溶液直接進樣法。

    6.對于基因毒雜質限度小于2ppm以下方法開發,優先選擇GC-MS溶液直接進樣法。

    五、確定定量方法

    1.外標法:殘留溶劑、含量(準確)

    2.內標法:殘留溶劑(主要針對易揮發烷烴類)

    3.面積歸一化法:樣品雜質分離及純度

    六、樣品預處理方法

    1.氣相色譜儀能直接分析的樣品通常是氣體或液體,固體樣品在分析前應當溶解在適當的溶劑中,而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分(如無機鹽:進樣口溫度不能保證鹽汽化),往往會聚集在進樣口襯管或分流平板導致污染/堵塞,還有可能通過載氣進入色譜柱中,損壞色譜柱的填料。

    2.樣品預處理/溶解原則:根據相似相溶原理。

    3.樣品分類:氣體樣品、液體樣品、固體樣品。

    4.氣體/液體樣品預處理方法:

    ①直接進樣分析(純度分析與檢測),如:甲烷、乙醇;

    ②脂溶性液體樣品(雜質),通常需要用脂溶性有機溶劑溶解樣品,如:甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、DMSO、DMF;

    ③進樣方式:溶液直接進樣、頂空進樣。

    5.固體樣品(含鹽)樣品預處理方法:

    ①樣品性質:易溶于水,難溶于有機溶劑,樣品熔點高,難汽化,如:鈉鹽/鉀鹽/鹽酸鹽/硫酸鹽/磷酸鹽/富馬酸鹽;

    ②如果選擇水作溶劑-盡量使用頂空進樣方法;

    ③靈敏度不理想且限度低(1-10ppm)-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法來進行預處理樣品,這樣既可以溶液直接進樣又可以頂空進樣,檢測雜質/殘留/基因毒通用。

    七、溶劑系統選擇

    1.如果是溶液直接進樣法,優先考慮溶劑選擇,溶解樣品的溶劑和最大溶解限度;如果是頂空進樣法,可根據樣品和溶劑都能溶解;

    2.原則上水溶性樣品優先選擇水,非水溶性樣品可選擇酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC;

    3.溶液直接進樣-樣品溶劑選擇考慮:

    ①化學穩定(水解/醇解),優先選擇水(水溶性)/醇/酯(脂溶性)作為溶劑;反之選擇烷烴、質子溶劑(萬能溶劑:DMF、DMSO、NMP、DMAC);

    ②樣品具有酸/堿性,但是檢測殘留溶劑或雜質也具備酸/堿性,可根據待測物質酸/堿性質選擇酸堿中和樣品;如鹽酸/硫酸/富馬酸鹽等產品檢測胺類,需要單獨使用堿性溶劑進行中和解離,同樣反之,如吡啶/鈉/鉀鹽等產品檢測酸類,需要單獨使用酸性溶劑進行中和解離(具體溶劑選擇,需要進行加標回收驗證實驗)。

    ③供試品溶液要澄清,不與樣品及待測物質反應或結合。

    4.頂空進樣-樣品溶劑選擇考慮:

    ①化學穩定(水解/醇解),優先選擇水(水溶性)作為溶劑;反之選擇質子溶劑(萬能溶劑:DMF、DMSO、NMP、DMAC);

    ②樣品具有酸/堿性,同上“3.②”。

    ③樣品溶解完全沒要求,頂空進樣氣體(溶劑殘留)。

    5.對于低限度燃燒值大的物質,可選用鹽析溶劑系統,如:苯殘留、三氯甲烷。

    6.樣品溶解溶劑選擇,也要考慮殘留溶劑的溶解度(如:烷、醚類不溶解水)。

    7.大部分溶劑系統優先選擇DMSO、NMP、DMF,因為既能溶解樣品又能溶解溶劑。

    八、柱溫開發研究

    1.等溫:對于溶劑個數?。?-3個),且各溶劑沸點差異不算很大,此時可選擇等溫法,比如50℃保持10-15分鐘(適合殘留溶劑檢測、基因毒雜質檢測、含量測定);

    2.程序升溫:對于溶劑個數多(大于5個),且各溶劑沸點差異較大,此時可選擇程序升溫法,比如40℃保持10分鐘,以10℃/min速率升至180℃,保持5分鐘(適用于產品雜質分離、殘留溶劑檢測);

    3.極端分離:對于大部分沸點低溶劑(當使用DB-624)且考慮分析時長時,可選用低溫程序升溫法,比如初始35-40℃(分析環境一定要保證<25℃);

    4.經典程序升溫(殘留溶劑、雜質分離):

    九、頂空條件方法選擇和研究

    1.爐溫(加熱-頂空瓶平衡溫度):

    ①以水為溶劑,溫度選擇范圍75-90℃,最高選擇90℃;

    ②以DMSO、DMF等為溶劑,溫度選擇范圍80-145℃,最高選擇140℃;溫度過高要考慮高溫時長導致溶劑反應降解產生新的未知雜峰;

    ③考慮溫度過高有爆瓶危險,特別在使用鹽析方法時(因為溶劑系統里水分存在)爆瓶概率增加;

    ④加熱溫度研究最高溫度一般低于溶劑10℃(在考慮靈敏度情況下)。

    2.定量環溫度:溫度要大于爐溫10℃;

    3.傳輸線溫度:溫度要大于定量環溫度10℃;

    4.頂空瓶(加熱)平衡時間:根據大部分溶劑沸點,沸點都相對高平衡時間就長,沸點相當都低平衡時間就短;常規平衡時間為30-60分鐘,經典平衡時間為30分鐘。

    十、檢測器選用

    1.90%分析方法工作優先選用FID檢測器:含碳氫化合物

    2.基因毒雜質選用FID-MS檢測器

    3.如含電負性基團(F/Cl/Br)且含CH量少,選用ECD電子捕獲檢測器,如三氯甲烷無H物質

    4.含有非碳氫化合物組分時,且對檢測靈敏度要求不高,通常選擇TCD檢測器,主要氣體檢測,如輔材:氮氣

    十一、方法建立

    1.進樣口溫度:一般選擇200-230℃,進樣口溫度要大于傳輸線溫度,可根據樣品性質研究選用中高溫,如150-180℃(考慮樣品不被熱解);

    2.檢測器溫度:一般230-260℃。檢測器溫度要大于進樣口和色譜柱溫度;

    3.流速:3.0-5.0mL/min,經典流速為:4和5mL/min;

    4.分流比:①5:1-50:1;②選擇規則-響應值高大分流比,反之則小分流比;③經典分流比為5:1(頂空進樣)和50:1(溶液直接進樣);

    5.進樣量:頂空進樣-1mL,溶液直接進樣-0.2-1uL,也可根據進樣峰型進行改進;

    6.樣品濃度/配制開發研究:

    ①頂空進樣:0.2-1g(根據限度/靈敏度要求進行研究),對于大濃度要考察樣品提取平衡;濃度一般控制在0.1-0.4g/mL(頂空裝量控制在1-5mL);

    ②溶液直接進樣:一定要考慮溶解完全,濃度可根據限度/靈敏度要求進行開發研究;一般控制在0.5-200mg/mL;

    ③開發研究合適的樣品濃度,一定要根據雜質限度/靈敏度做相應研究調整。

    7.對于雜質分離(溶液直接進樣法),在方法開發同時也要考察殘留問題,可增加清洗老化色譜柱方法程序,也可增加清洗進樣針方法;還有對于對氣相管路有吸附殘留性質也可增加清洗程序(如胺類、>150℃高沸點物質),增加程序一定要作為分析方法的一部分,且一定要經過驗證驗收。

    8.系統干擾考察研究:先走空白2針,樣品1針、對照1針,查看空白、樣品溶液的干擾情況,空白與樣品應無干擾峰出現(方法驗證-專屬性),且對LOQ和LOD測試無干擾,基本能通過LOQ和LOD驗證(方法好壞體現在系統與溶劑對測試的干擾);

    9.最后進行100%加標回收測試,回收結果如果滿足90%-105%,方法基本確定。

    十二、分析方法評價

    1.分析方法開發評價標準:

    ①空白考察:空白溶液無干擾峰出現,應該對測試無影響(最小干擾<LOD);

    ②分離度:最低分離度標準為,各相鄰峰間分離度>2.0(最小1.5);

    ③LOQ:確認靈敏度(響應值)最小的2個,將LOQ試驗出來,LOQ對應濃度是否合格(LOQ含量不得高于限度的50%),且LOQ的S/N要大于10;

    ④加標回收標準(90-110%);

    ⑤溶液穩定性:100%加標溶液考察0、2、4、8、24小時的穩定性,主要考察峰面積RSD%(n=5)以及各溶劑的回收率%。

    結語:干一行愛一行!冰凍三尺非一日之寒!需要我們不斷學習探究,不斷去實踐不斷扎實自己,對GC方法開發同時也需要我們扎實的儀器分析基本功,對GC色譜理論知識的剖析和挖掘,更要我們對GC儀器的熟練操作能力,這樣我們的工作會事半功倍。

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